长治市热启动Taq酶研发

动物疫病诊断的主要内容有:一是对血、 尿、粪等进行临床常规化验;二是从流行病学角度，调查研究动物疫病流行情况，主要调查动物发病时间及地点、疫病蔓延情况、疫情来源及传播的途径与方式等;三是从病理学方面，剖检因忠传染病而死亡的畜禽尸体，查看其病理变化，或者取病料进行送检，再进一步做病理组织学方面的诊断;四是从微生物学角度，检查、坚定从患病的畜禽病料当中分离并且培养出来的病原微生物，或者是进行动物接种试验等，五是从免疫学角度，对组织或者细胞的变态反应、细胞的免疫功能及血清学反应等进行诊断。

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大部分分子诊断实验室的核心技术都主要集中在检测特异性、相对较短的DNA或RNA片段上。该技术能诊断传染性疾病、鉴别影响药物代谢的特殊基因变异型或检测与疾病有关的基因，如与癌症有关的基因。这些检测的核心是实时定量聚合酶链反应（PCR）、转录调节扩增（TMA）、靶向扩增和信号扩增等类似技术的应用。桑格排序和DNA片段分析或采用毛细电泳法的凝胶法都是分子诊断实验室的关键技术，但他们通常还包括检测过程中的扩增步骤。为了能顺利应用那些采用DNA和RNA来诊断疾病的检测，分子诊断实验室须要使用定义明确的工作流程，从而得到稳定的、有效的结果，而当前已存在能帮助诊断实验室实现每个工作流程流水化的特殊工具。

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热启动PCR（hot start PCR）是指使Taq DNA 聚合酶只有在样品温度至少超过70℃时才发挥作用的PCR，可提高反应的特异性。Taq DNA 聚合酶通常在比适宜温度低得多的条件下仍有较强的活性。PCR 反应的初加热过程中，样品温度上升到70℃之前，在较低的温度下引物可能与部分单链模板形成非特异性结合，并在Taq DNA 聚合酶的作用下延伸。结果会导致非靶序列的扩增，影响反应的特异性。热启动可减少非靶序列的扩增，提高反应的特异性。在引物设计时如果某位点因为遗传元件的定位而受限，如site-directed 突变、表达克隆或用于DNA 工程的遗传元件的构建和操作等情况，热启动PCR 尤为有效。

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在动物疫病诊断中，化验室的操作较为关键，对诊断的结果有直接的影响。但是，在当前实验室操作中还存在一-些问题，如检测操作中、检测报告中未填写、不开具《检测委托书》等这些问题的存在严重影响动物疫病的诊断，不利于动物疫病的防控。因此，在今后工作中，需要对相关工作制度进行不断地完善，促使化验室的操作更加规范化、科学化;加强对实验室人员的专业培训，提高其操作水平。只有这样才能提高动物疫病检测的准确性，为我国的动物疫病防控工作做好铺垫。

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Taq DNA聚合酶具有很高的加工合成特性，在适反应温度时，dNTP的掺入速度为35～100 nt/（s．酶分子），扩增长度可达7.6 kb。在低温条件下，Taq DNA聚合酶的活性明显降低，导致此酶在模板内局部二级结构区域的延伸能力受阻或前进速率常数与解离常数的比值发生改变。在较高的温度（95℃以上）时，很少有DNA合成；在体外，DNA在较高温度时的合成速度受到引物或引物链与模板链双链结构稳定性的限制。由于Taq DNA聚合酶的适反应温度高达75～80℃，故退火温度和延伸温度均可适当提高，这限制了非特异性扩增产物的出现，增加了PCR反应的特异性。

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热启动通过抑 制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR 仪达到变性温度。延缓加入Taq DNA 聚合酶的手工热启动方法十分烦琐，尤其是对高通量应用。其他热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分(镁离子、酶、模板、缓冲液等) 隔离开。在热循环时，蜡熔化把各种成分释放出来并混在一起。蜡防护层法同样比较烦琐，易于污染，不适用于高通量应用。